En esta secuela de Noche en el Museo, el Museo de Historia Natural cierra sus puertas para una restauración, y todos los artículos exhibidos se guardan en el Archivo Federal en Washington, D.C.
 | Ben Stiller | Larry Daley |
 | Amy Adams | Amelia Earhart |
 | Hank Azaria | Kahmunrah / El Pensador / Abe Lincoln |
 | Owen Wilson | Jedediah Smith |
 | Steve Coogan | Octavius |
 | Christopher Guest | Iván el Terrible |
| Alain Chabat | Napoleón Bonaparte |
| Jon Bernthal | Al Capone |
 | Robin Williams | Teddy Roosevelt |
| Bill Hader | General George Armstrong Custer |
| Mizuo Peck | Sacajawea |
| Ricky Gervais | Dr. McPhee |
| Patrick Gallagher | Atila el Huno |
| Jake Cherry | Nicky Daley |
 | Eugene Levy | Voz de Albert Einstein |
 | Jonah Hill | Brundon |
| Jay Baruchel | Joey Motorola |
| Keith Powell | Aviador de Tuskegee #1 |
| Craig Robinson | Aviador de Tuskegee #2 |
| Rami Malek | Akhmenrah |
| Mindy Kaling | Guía del Smithsonian |
| Ed Helms | Empleado de Larry |
 | Robert Ben Garant | Orville Wright |
 | Thomas Lennon | Wilbur Wright |
