La historia se centra principalmente en el Escuadrón Suicida, particularmente en los villanos de Batman Deadshot y Harley Quinn, con Batman en un papel secundario. En la película, un Escuadrón Suicida de seis criminales es enviado por una agencia secreta del gobierno para irrumpir en el Asilo Arkham, donde deben luchar con los internos del asilo y Batman mientras intentan completar su misión.
 | Kevin Conroy | Batman / Bruce Wayne |
 | Neal McDonough | Deadshot / Floyd Lawton |
| Hynden Walch | Harley Quinn / Harleen Quinzel |
| Matthew Gray Gubler | The Riddler / Edward Nigma |
| Troy Baker | The Joker |
| Eric Bauza | Security Guy |
| Chris Cox | G.C.P.D. Commissioner James Gordon |
| John DiMaggio | King Shark / Nanaue / Bane |
| Greg Ellis | Captain Boomerang / George Harkness |
 | Giancarlo Esposito | Black Spider / Eric Needham |
| Jennifer Hale | Killer Frost / Louise Lincoln |
| Martin Jarvis | Alfred Pennyworth |
| Peter Jessop | Watch Commander |
| Christian Lanz | Scarecrow / Dr. Jonathan Crane / Victor Zsasz |
| Nolan North | The Penguin / Oswald Cobblepot / KGBeast / Anatoli |
